Opstartfase voorbij

Dat een promotieonderzoek van vier jaar een vrij lange periode is om ergens helemaal in te duiken, zal haast eenieder beamen. Maar eenmaal begonnen aan zo’n traject, lijkt de tijd die je voor je onderzoek hebt gekregen ineens toch een stuk minder onmetelijk. Na vier maanden acclimatiseren, inlezen, experimenteren en bijleren in Delft, moet mijn eigen project nog goed en wel beginnen. Eén twaalfde voorbij; de eerste maand van mijn PhD-‘jaar’ verleden tijd. Wat heb ik in vredesnaam afgelopen tijd uitgespookt?

“doe mij wat ntps aub” – schematische voorstelling van een RNA-polymerase.

Tijd verspild heb ik gelukkig allerminst; mijn eerste maanden laten zich goed omschrijven als learning on the job. In samenspraak met mijn promotor Nynke Dekker hebben we in den beginne besloten dat mijn wens om de wereld van de single-molecule biophysics (enkel-molecuul biofysica vind ik echt te vreemd klinken, ik hou de anglicaanse benaming wel aan) in te duiken zou worden vervuld door middel van experimenteren met behulp van de magnetische pincet (officieel magnetic tweezers natuurlijk, hier vind ik het Nederlandsch nog net kunnen). De zeer pientere, bourgondisch ingestelde en ietwat chaotische post-doc tevens ontzettende Fransman David Dulin werd mijn mentor om me dit experimenteel trucje (fijne kneepjes van het vak incluis) aan te leren. Naast een zeer goede samenwerking te hebben gehad, hebben we zijn project aan de RNA-afhankelijke RNA-polymerase succesvol naar een afrondende fase weten te brengen. “Juist. Magnetische pincet, een RNA-wat?” hoor ik sommigen nu denken. Hier komt ie dan:

Een RNA-afhankelijke RNA-polymerase is kort gezegd een enzym dat RNA polymeriseert (kopieert), en hiervoor niet dubbelstrengs DNA, maar dubbelstrengs (ds) RNA gebruikt.  dsRNA neemt net als DNA een helixvorm aan, enkele virusfamilies gebruiken dit i.p.v. DNA als erfelijk materiaal. Het enzym dat we hier onderzoeken komt voor in bacteriofaag phi6 (een virus dat bacterien infecteert), en wordt P2 genoemd.

Het P2-onderzoek is een analyse van het gedrag van het P2-enzym op het moment dat het dsRNA kopieert. Hoe snel kopieert de P2 de RNA-streng? Hoe vaak pauzeert het en hoe lang pauzeert het? Keert het ook op zijn schreden terug? Wat gebeurt er als je aan het RNA trekt of de nucleotideconcentratie (de concentratie van de bouwstenen van RNA) verlaagt? Kortom: wat zijn de kinetische/mechanische eigenschappen van deze moleculaire kopieermachine? Dit zijn allemaal typische vragen die met dit soort single-molecule experimenten – en in dit geval met de magnetische pincet – kunnen worden beantwoord.

Het experiment ziet er als volgt uit: in een speciaal hiervoor ontworpen, handgemaakte vloeistofcel wordt dsRNA aan één uiteinde chemisch aan een oppervlak gebonden (met behulp van anti-lichamen). Het andere eind van het moleculaire elastiek wordt chemisch op een gelijksoortige manier aan een magnetisch balletje bevestigd. Het geheel bevindt zich in een microscoop-opstelling met een CCD camera als detector. Plaats een magneet vlak boven de flowcell et voilà: de magnetische bollen trekken aan het RNA onder invloed van het magnetisch veld. Bijna klaar voor single-molecule detectie. Vervolgens kan het enzym naar binnen worden gespoeld, in de loop van een half uur binden de eiwitten op het RNA. Daarna spoel je alle door de oplossing drijvende (al is diffuserende hier de correcte term) P2s eruit en start je de reactie door rNTPs – die moleculaire bouwstenen van RNA (ATP, CTP, GTP, UTP) – naar binnen te spoelen.

“kopieren kun je leren” – De schematische voorstelling van de P2-reactie. De dubbele streng wordt omgezet in een enkele, rekbaardere streng.

Als het goed is weet de aan dsRNA gebonden P2 wel raad met deze bouwstenen en zet het de aan-de-magnetische-bol-gebonden helft van de dsRNA-helix om in enkelstrengs RNA (schematisch afgebeeld hierboven). Enkelstrengs RNA is minder rigide en rekbaarder dan dubbelstrengs RNA, hierdoor zie je een toename in lengte van het gespannen touw. De snelheid van deze lengteverandering wordt zo een maat voor de snelheid, pauzefrequentie en pauzeduur van het P2-enzym.

“is dat alles?” – Wat je uiteindelijk krijgt is dus een grafiek van de lengteverandering in de tijd, pauzes incluis.

Dit onderzoek maakt dus deel uit van het onderzoek naar de werking van virussen, met in eerste instantie als doel om meer te kunnen begrijpen van de werkingsmechanismen hiervan. Op de lange termijn moet dit onderzoek dus een bijdrage leveren aan een effectiever optreden tegen moleculaire invasies van dit soort. Op het moment van schrijven hebben we alle metingen afgerond en hebben we een indrukwekkende hoeveelheid data (m.i. zowel kwaliteit als kwantiteit) bij elkaar gemeten. Met name David is nu aan het manuscript aan het werken, het is tenslotte nog wel voornamelijk zijn project. Zodra publicatie in zicht is volgt een meer gedetailleerde beschrijving van dit project, de analyse en de resultaten.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *