Om te beginnen, waar de single-molecule magnetic tweezerstechniek zich hiervoor beperkte tot statistieken van enkele tot maximaal enkele tientallen metingen, omvat deze studie bij elkaar ruim 1000 unieke metingen aan individuele RNA polymerases. Technische vooruitgang op het gebied van camera’s en trackingsoftware hebben dit mogelijk gemaakt. Hoewel wij niet de enige groep zijn die dit soort technische vooruitgangen boekt, laten wij de mogelijkheden die de techniek biedt zien aan de hand van een biologisch vraagstuk. Zonder deze capaciteitsuitbreiding was dit onderzoek niet mogelijk geweest.
Anno 2011, toen ik begon met het opnemen van data, lag de maximale hoeveelheid RNA moleculen die we tegelijk konden visualiseren met behulp van magnetische balletjes – ik noem ze beads vanaf nu – rond de 80 op een goede dag. Nu ligt dat op 500-600. Dat dit mogelijk is ligt aan een combinatie van twee dingen: 1) meer megapixels in een camera: in 2011 hadden we een 1.4 megapixel camera, nu een 12 megapixel camera. 2) Een norme ontwikkeling in de software die het mogelijk maakt om gigabytes aan data per seconde te kunnnen verwerken. Er is dus aan het RNA-preparaat niets veranderd, het is de grootte van het oppervlak die we met een foto kunnen bestrijken (zonder kwaliteitsverlies) dat enorm is toegenomen. De echte uitdaging ligt hier voor ons natuurlijk niet in het kopen van een camera met meer megapixels, maar in hoe we ervoor zorgen dat een pc deze enorme toename aan hoeveelheid data nog steeds binnen een redelijke tijd kan verwerken.
Met verwerken van data bedoel ik hier alleen het omzetten van beeld van een bead naar een locatie met x,y,z coordinaten. Van een foto naar 3 cijfers dus. Ter illustratie, anno 2011: het opzetten van dit experiment kost zo’n 2-3 uur. Meten duurt een minimaal een half uur, dataverwerking in 2011 duurde ongeveer een uur voor een experiment met 15 beads. De opnamesnelheid ligt op 25 beelden per seconde,1800 seconden maakt 45000 beelden. De beelden, van enkele honderden kilobyte per stuk, werden allemaal opgeslagen, dus 1 experiment gaf gigabytes aan beeldmateriaal. De harde schijven draaiden op volle toeren. Het achteraf (offline dus) omzetten van de beelden naar x,y,z cijfers duurt dus ongeveer 2 keer zo lang als het experiment zelf, omdat je per foto zo’n 15 regio’s hebt die je volgt en moet omzetten in coordinaten. Voor het maximale van 80 beads kon het verwerken letterlijk een hele nacht duren. Er moest dus iets veranderen.
Enter Jelmer Cnossen, student bioinformatica en een zeer getalenteerd programmeur. Ik heb inmiddels duizenden regels code geschreven en vele leuke dan wel (voor mezelf) nuttige programmatjes geschreven, maar aan deze whiz kid op de pc kan ik bij lange na niet tippen. Daarnaast ook nog erg gezellig om een avondje mee in de kroeg te zitten, ondanks alle vooroordelen die er over programmeurs bestaan. Jelmer heeft op aangeven van David en met experimentele terugkoppeling van mij een programma uit de grond gestampt dat alle beads volgt en geen beelden opslaat, maar meteen de informatie die de camera naar de pc stuurt in x,y,z coordinaten omzet. Online tracking heet dat. Hiervoor moeten de tracking-algoritmes ordes van grootte sneller zijn dan wat we tot dan toe hadden, en maakt het programma mits nodig gebruik van parallel-processing op een grafische kaart (CUDA tracking) in plaats van de berekeningen op de gewone processoren uit te voeren. We kunnen nu met gemak een experiment van 500 beads opnemen met snelheden rond 60 Hz, en als we willen kiezen voor hoge tijdsresolutie kunnen we tot 4 beads volgen tot snelheden van 8000 Hz. Exit trackingprobleem.
Ga door naar punt 2.
NB Nu lopen we weer tegen andere dingen aan, namelijk hoe we zorgen dat er genoeg fotonen op de camerachip terechtkomen, bij 8kHz is de maximale sluitertijd 1/8000 = 0.000125 seconde. Dat is een slordige 1000 keer korter dan de tijd die je nodig hebt om met je ogen te knipperen. Fellere LEDs zijn op een gegeven moment ook niet goed genoeg meer, met lasers lukt het wel, al hebben deze (coherente) lichtbronnen ook weer zo hun eigen problemen.
NB2 David en Jelmer hebben een mooi en zeer leesbaar paper over de trackingalgoritmes gepubliceerd, en de software hebben we vrijgegeven, die kun je hier downloaden (nerdalert, dit is geen plug&play code).