A protein in a box

Exactly one year ago today I defended my doctoral thesis in Delft. Fast-forward one year, and I find myself writing these words in the California sun. How different life has become! Having embarked on an exciting new project, I am now challenged to think about a whole new universe of fascinating problems. Yet I do enjoy looking back every now and then to remember the good times of grad school. The good times of a protein in a box.


What is life? At the very least it is a concept that we humans find surprisingly difficult to define. Though generally wet and dynamic1, arguments about what defines life inevitably involve terms like ‘reproduction’, ‘growth’, and ‘adaptation’ – matters very common to cells and viruses alike, yet whether the latter belong to the category of living things is a matter of ongoing debate. For the purpose of this thesis (as well as for my own understanding), I adopt a less materialistic and more conceptual definition of life:

Life is a process brought forward by the self-organization of molecules, a process that seemingly violates the second law of thermodynamics2 as it increasingly acquires and maintains information over timescales that vastly exceed the lifetime of the molecules holding this information.

In this manner the distinction between a virus and a cell becomes rather meaningless: viruses are just as much part of the process that we know as ‘life’ as a homo sapiens like you or me is.3 In addition, it allows me to conveniently classify my thesis work as “an effort to gain better understanding of the molecular processes and building blocks of life”. Though this classification is rather broad – as myriads of doctoral theses written over the past century or so belong to this category – my thesis belongs to a relatively small and novel subcategory of the ‘gaining insight into the building blocks of life’ class by making use of two concepts: single-molecule and bottom-up approach.

Continue reading “A protein in a box”

Tus fuss (1)

 

The main actors.

My Tus paper in the news, those interested can start reading up. Again, more to follow

 

Today’s headlines

Is it a bird? Is it a plane? No: It’s my project on the cover of Nature Chemical Biology!

Tussle stories.

More will follow soon, for the time being I’ll quote the Journal:

“A single-molecule approach using magnetic tweezers shows that DNA strand separation alone can trigger a lock at Tus–Ter sites where oppositely moving replisomes on circular bacterial chromosomes must avoid crashing. The results support a ‘mousetrap’ model in which replication-related proteins are not necessary and strand separation is followed by an interaction between Tus and C6 of the Ter site that sets up a hierarchy of interactions to allow the Tus–Ter complex to progressively strengthen. Cover art by Erin Dewalt, based on an image provided by TU Delft/Tremani.”

Het ei is gelegd: een polymerasepaper in 4 stappen

Zo, het heeft even geduurd, maar eindelijk is het dan zover: het ei is gelegd. In de vorm van een artikel, dat dan weer wel. Leefde ik aan het eind van mijn eerste jaar (anno 2012) nog in de waan dat het een kwestie van weken zou zijn voor publicatie, weet ik nu dus wel beter. Het p2 onderzoek waar ik een flinke bijdrage aan heb geleverd – waardoor het werk een stevige positie in mijn toekomstige proefschrift heeft gekregen – heeft van begin tot eind zo’n 7 jaar in beslag genomen.* Karakteriseren met termen als ‘uitputtingsslag’ of ‘marathon’ zou derhalve een understatement zijn. Hoewel het gros van de data in 2012 al gemeten is, heeft het verhaal in de jaren daarna met name wat dataverwerking en -analyse betreft nog een enorme ontwikkeling doorgemaakt. Wat we nu presenteren is een compleet verhaal geworden dat zowel op experimenteel als op theoretisch vlak vernieuwend is. Dit zeg ik niet alleen omdat ik bevooroordeeld ben, om 4 redenen brengt dit werk wat nieuwe dingen naar voren, begin hier met lezen!

NB Is deze tak van sport helemaal nieuw? Lees dan hier waarom we überhaubt aan een enkel molecuul zouden willen meten, hier een inleiding over de magnetische pincet (magnetic tweezers) en hier mijn vorige verslag over dit project. Continue reading “Het ei is gelegd: een polymerasepaper in 4 stappen”

1. Eindelijk fatsoenlijke MT statistiek dankzij multiplexen.

Om te beginnen, waar de single-molecule magnetic tweezerstechniek zich hiervoor beperkte tot statistieken van enkele tot maximaal enkele tientallen metingen, omvat deze studie bij elkaar ruim 1000 unieke metingen aan individuele RNA polymerases. Technische vooruitgang op het gebied van camera’s en trackingsoftware hebben dit mogelijk gemaakt. Hoewel wij niet de enige groep zijn die dit soort technische vooruitgangen boekt, laten wij de mogelijkheden die de techniek biedt zien aan de hand van een biologisch vraagstuk. Zonder deze capaciteitsuitbreiding was dit onderzoek niet mogelijk geweest.

Grootte van het beeld anno 2009.

Anno 2011, toen ik begon met het opnemen van data, lag de maximale hoeveelheid RNA moleculen die we tegelijk konden visualiseren met behulp van magnetische balletjes – ik noem ze beads vanaf nu – rond de 80 op een goede dag. Nu ligt dat op 500-600. Dat dit mogelijk is ligt aan een combinatie van twee dingen: 1) meer megapixels in een camera: in 2011 hadden we een 1.4 megapixel camera, nu een 12 megapixel camera. 2) Een norme ontwikkeling in de software die het mogelijk maakt om gigabytes aan data per seconde te kunnnen verwerken. Er is dus aan het RNA-preparaat niets veranderd, het is de grootte van het oppervlak die we met een foto kunnen bestrijken (zonder kwaliteitsverlies) dat enorm is toegenomen. De echte uitdaging ligt hier voor ons natuurlijk niet in het kopen van een camera met meer megapixels, maar in hoe we ervoor zorgen dat een pc deze enorme toename aan hoeveelheid data nog steeds binnen een redelijke tijd kan verwerken.

Continue reading “1. Eindelijk fatsoenlijke MT statistiek dankzij multiplexen.”

3. Bayesiaanse statistiek en maximum likelihood estimation.

Een van de meest vernieuwende stappen in het wetenschappelijke veld die dit artikel met zich meebrengt is het fitten van een kinetisch model aan de complexe dwelltimedistributie waarover ik in mijn vorige punt uitwijdde. We hebben een distributie aan tijden die niet voor een gat te vangen is, dus het lijkt erop dat er een combinatie van verschillende verdelingen nodig is om de data te beschrijven. Waarom we dit doen leg ik in het laatste punt uit, maar we doen dit met behulp van een methode ontleend uit de Bayesiaanse statistiek: de maximum likelihood estimation.

Dit behoeft wat uitleg. Of nou ja, ik zou het model ook zonder deze andere vorm van statistiek uit kunnen leggen, maar het toepassen van deze statistische methode in de single-molecule biofysica is vernieuwend en verdient daarom een afzonderlijke post. Daarnaast, waarom zou ik iemand uitleg over een mooie statistische stroming willen onthouden? Mocht u bij het lezen van het woord ‘statistiek’ een aanval van blinde paniek krijgen: ga dan door naar het volgende punt.

Het overgrote deel van de statistiek die tegenwoordig toegepast wordt is de klassieke of frequentistische (is dat een woord?) interpretatie van kansrekening. Ze is gebaseerd op de aanname dat je uit een eerder gemeten dataset kunt afleiden of een nieuw gemeten datapunt afwijkt en hoe groot de kans (de p-waarde) is dat dit gebeurt. Hoe ver het punt afwijkt wordt getoetst aan een nulhypothese die zegt: je nieuwe datapunt hoort bij de verzameling oude datapunten. De nulhypothese wordt vervolgens al dan niet verworpen op basis van een vooraf bepaald criterium en een de p-waarde die aangeeft hoe zeker je van je zaak kunt zijn. Er wordt verder geen enkele aanname gemaakt, er wordt alleen gekeken of de nulhypothese klopt, met soms absurde conclusies als resultaat. Een mooi voorbeeld hiervan is octopus Paul, de duitse ongewervelde die zo beroemd werd tijdens het WK van 2010 omdat hij een hoop wedstrijden achter elkaar goed voorspeld had. De nulhypothese – Paul is niet helderziend – werd volgens de klassieke statistiek verworpen, met een officieel als helderziend bestempelde octopus als gevolg.*

Continue reading “3. Bayesiaanse statistiek en maximum likelihood estimation.”

4. Puzzelstukken combineren, modelleren, verklaren.

Gefeliciteerd! U heeft het einde gehaald, terwijl ik nog zo mijn best heb gedaan om lezers af te schudden. Maar daar zijn we dan: wat leren al deze experimenten, data-analyse, statistisch geneuzel enzovoorts ons allemaal? Waar doen we het voor? Begrijpen we de wereld om ons heen nu ook beter? De experimenten, bestaande literatuur, statistiek en andere dataverwerkingsmethoden zijn allemaal stukjes van een puzzel, of geven ons een idee hoe de puzzel in elkaar gezet kan worden, maar uiteindelijk gaat het om het oplossen van de puzzel.

Een eerste stel puzzelstukken die we nu hebben bestaat uit informatie over de structuur van de polymerase hebben:

Polymeriseren kun je leren.

Aan de de dwarsdoorsnede van de polymerase kun je zien dat het molecuul 3 tunnels heeft die in het midden samenkomen. Dit ligt redelijk voor de hand: binnenin de polymerase wordt enkelstrengs RNA omgezet (gepolymeriseerd) naar de vertrouwde dubbele helixvorm. De eerste tunnel gaat enkelstrengs RNA naar binnen, tunnel 2 voert dubbelstrengs RNA naar buiten. Om dit te kunnen doen heb je ook aanvoer van bouwstenen nodig (NTPs dus), hier is tunnel nummer 3 voor. Rechts zie je hoe dit in het experiment gebeurt.

Continue reading “4. Puzzelstukken combineren, modelleren, verklaren.”

Let’s talk Tweezers

Let’s talk tweezers. Magnetic Tweezers, that is – de lekenversie. Toegegeven niet het meest spannende verhaal op deze site, ondanks dat interessant en momenteel niet weg te denken uit mijn dagelijks bestaan. Voor het nageslacht zullen we maar zeggen. De techniek bestaat inmiddels al een aantal decennia, en het woord ‘magnetic’ verraadt al een goed deel van het verhaal. De kracht van deze truc schult in het feit dat het concept zelf – alsmede het opzetten van een experiment – vrij eenvoudig is, terwijl er toch gecompliceerde systemen op het niveau van een enkel molecuul mee onderzocht kunnen worden.

Eureka.

Zoals eerder beschreven voer je je experiment uit in een vloeistofcel ter grootte van een microscooppreparaatplaatje. Deze zogenaamde flow cell bevindt zich in een microscoop-opstelling, met bijbehorende lichtbron, objectief en camera voor beeldregistratie. Verder komt er nog één attribuut bij kijken: de magneet natuurlijk.

Continue reading “Let’s talk Tweezers”