A protein in a box

Exactly one year ago today I defended my doctoral thesis in Delft. Fast-forward one year, and I find myself writing these words in the California sun. How different life has become! Having embarked on an exciting new project, I am now challenged to think about a whole new universe of fascinating problems. Yet I do enjoy looking back every now and then to remember the good times of grad school. The good times of a protein in a box.


What is life? At the very least it is a concept that we humans find surprisingly difficult to define. Though generally wet and dynamic1, arguments about what defines life inevitably involve terms like ‘reproduction’, ‘growth’, and ‘adaptation’ – matters very common to cells and viruses alike, yet whether the latter belong to the category of living things is a matter of ongoing debate. For the purpose of this thesis (as well as for my own understanding), I adopt a less materialistic and more conceptual definition of life:

Life is a process brought forward by the self-organization of molecules, a process that seemingly violates the second law of thermodynamics2 as it increasingly acquires and maintains information over timescales that vastly exceed the lifetime of the molecules holding this information.

In this manner the distinction between a virus and a cell becomes rather meaningless: viruses are just as much part of the process that we know as ‘life’ as a homo sapiens like you or me is.3 In addition, it allows me to conveniently classify my thesis work as “an effort to gain better understanding of the molecular processes and building blocks of life”. Though this classification is rather broad – as myriads of doctoral theses written over the past century or so belong to this category – my thesis belongs to a relatively small and novel subcategory of the ‘gaining insight into the building blocks of life’ class by making use of two concepts: single-molecule and bottom-up approach.

Continue reading “A protein in a box”

Scientific lubricant

Remember me writing about how stressful life as a last-year grad student was? How many of us walk around sleep deprived, nervous and pale in the face? Forget about all that, life as a final year grad student rocks!

Climbing peaks in Aspen: single-molecule biophysicists in the Rockies. (Steve Block’s Single-Molecule Biophysics meeting, Aspen, CO)

Let me tell you why. For the better part of 3 years you have spent an innumerable amount of time trying to figure out why you are the right (wo)man for the job, messing up, experimenting with flexible working hours, procrastinating, doing useful and less useful experiments, isolating yourself from family/friends/daylight, feeling insecure about your future and ignoring important e-mails from department secretaries. You may even have contemplated quitting, or at least pondered what life would be like as a diving instructor, mountaineering guide or Buddhist monk. But now all of a sudden the mist that clouded you so hopelessly has cleared up as if being burnt away by the morning sun: now you have a story to tell. This means it’s conference time!

And some more in the Alps (Kavli institute Delft retreat, Courchevel, France). 

Those outside academia might now be wondering whether the clearing of the above-mentioned mist also took away my last bit of sanity, but those in science know better. For scientists may not earn six-figure salaries, they will not find themselves surrounded by groupies on a regular basis, and they may have to spend days on end measuring in a basement, but I have to say: they sure know how to treat themselves to a proper intellectual retreat.

Continue reading “Scientific lubricant”

Het ei is gelegd: een polymerasepaper in 4 stappen

Zo, het heeft even geduurd, maar eindelijk is het dan zover: het ei is gelegd. In de vorm van een artikel, dat dan weer wel. Leefde ik aan het eind van mijn eerste jaar (anno 2012) nog in de waan dat het een kwestie van weken zou zijn voor publicatie, weet ik nu dus wel beter. Het p2 onderzoek waar ik een flinke bijdrage aan heb geleverd – waardoor het werk een stevige positie in mijn toekomstige proefschrift heeft gekregen – heeft van begin tot eind zo’n 7 jaar in beslag genomen.* Karakteriseren met termen als ‘uitputtingsslag’ of ‘marathon’ zou derhalve een understatement zijn. Hoewel het gros van de data in 2012 al gemeten is, heeft het verhaal in de jaren daarna met name wat dataverwerking en -analyse betreft nog een enorme ontwikkeling doorgemaakt. Wat we nu presenteren is een compleet verhaal geworden dat zowel op experimenteel als op theoretisch vlak vernieuwend is. Dit zeg ik niet alleen omdat ik bevooroordeeld ben, om 4 redenen brengt dit werk wat nieuwe dingen naar voren, begin hier met lezen!

NB Is deze tak van sport helemaal nieuw? Lees dan hier waarom we überhaubt aan een enkel molecuul zouden willen meten, hier een inleiding over de magnetische pincet (magnetic tweezers) en hier mijn vorige verslag over dit project. Continue reading “Het ei is gelegd: een polymerasepaper in 4 stappen”

2. Onbevooroordeelde dataverwerking: de dwelltime-analyse.

Goed, je hebt je x,y,z data, en dan? Dwelltime-analyse is een abstracte term voor een vrij eenvoudige methode. Niet al te ingewikkeld dus, maar eerder op dit soort data toegepast? dat niet. Wat ik eerder heb laten zien was dat een polymerase dubbelstrengs RNA omzet in enkelstrengs RNA (een verplaatsing van y baseparen) over een tijd x. Met andere woorden, de polymerase heeft een snelheid gemeten in baseparen per seconde, die we willen weten. Als die snelheid constant zou zijn is het makkelijk: de verplaatsing uitgezet tegen de tijd is dan lineair – de snelheid zouden we meteen af kunnen lezen.

Positie van RNA polymerase versus tijd.

Dat is in feite wat er tot nu toe altijd gedaan is: de polymerasesnelheid wordt gemeten voor elk stukje van het (door de polymerase afgelegde) traject waarvan het lijkt dat de snelheid constant is. Met andere woorden: elk stukje van het traject waar je een rechte lijn tegenaan kunt leggen levert je een snelheidsvector op. Klaar! Zou je zeggen. Maar: hoe weet je zeker dat een stuk waar je een lijn tegenaan legt ook daadwerkelijk een constante snelheid vertegenwoordigt? Akkoord, voor een ruwe schatting is dit prima, anno 2005 had je zo in Nature gestaan. Maar het is 2015 en een meting aan een enkel molecuul is geen wereldwonder meer. Toch vormen dit soort metingen een onmisbare bron aan informatie over de dynamiek van deze moleculaire kopieermachines.

Continue reading “2. Onbevooroordeelde dataverwerking: de dwelltime-analyse.”

2½. Dwelltimedistributies

Dacht je naar punt 3 door te kunnen, krijg je dit! Toch eerst maar even kijken wat ik precies bedoel met de dwelltimedistributies. Stel je hebt een dataset die alle verkregen dwelltimes van een experiment bevat, een lange lijst met tijden dus. De set die ik hier heb bestaat uit 15417 tijden verkregen door 60 trajecten op te knippen in stukken van 10 baseparen. Op die 10 baseparen kom ik aan het eind weer terug, nu eerst de tijden. Het minimum ligt bij 0.08 seconden: de polymerase vestigde een snelheidsrecord in dat stuk. De langste tijd – met andere woorden langste pauze – duurde 98.8 seconden. Alle andere 15415 punten liggen dus daar ergens tussenin. Je kijkt hoe de verdeling van tijden eruitziet door de data in een histogram te stoppen. Hierbij verdeel je die kleine 100 seconden in tijdsintervallen van gelijke grootte (bins) en tel je hoeveel van de tijden er binnen elk tijdsinterval liggen:

Abnormaal verdeeld: Als je het zo bekijkt lijkt er nauwelijks een dwelltime boven de 5 seconden te liggen..
Ondergesneeuwde data: Maar als je inzoomt zie je dat er toch nog wel wat datapunten bij hogere tijden liggen!

Daar is niet veel anders over te zeggen dat de overweldigende meerderheid van de dwelltimes niet veel langer is dan zo’n 5 seconden. Tijd voor een logaritmisch geschaalde histogram (log-histogram):

Dezelfde data op een logaritmische tijdschaal.

Continue reading “2½. Dwelltimedistributies”

3½. Bootstrapping

Voordat we doorgaan naar de climax van het verhaal toch nog een klein intermezzo: bootstrapping! Boot-wat? Boot-waarom? Een betrouwbaar wetenschappelijk verhaal is gebaseerd op betrouwbare data, dat klinkt logisch. Maar hoe betrouwbaar is betrouwbaar? Om de betrouwbaarheid van data aan te geven zie je soms error bars en soms betrouwbaarheidsintervallen op datapunten. Voorbeeld: In het laatste figuur van deel 2 (de polymerasesnelheid versus kracht) steken aan weerszijde van elk datapunt horizontale balkjes uit die eindigen met een balkje dat daar haaks op staat. Dit zijn error bars en ze geven aan waar het datapunt met nog een vrij grote waarschijnlijkheid ook zou kunnen liggen. Horizontaal betekent dat we het over de x-as hebben, ofwel de onzekerheid in de kracht die we uitoefenen.*

Virtueel de meting herhalen. Dataset x (blauw) en een gebootstrapte set r1 (rood), de verdelingen lijken erg op elkaar maar willekeurigheid maakt ze niet identiek.

Stel nu je hebt een dataset met een bepaalde verdeling, zoals ik in punt 2½ had. Hoe betrouwbaar is deze dataset? Moet ik dan nog een aantal keer opnieuw die 15417 punten bij elkaar meten en kijken wat de variatie is die ik krijg? Dat zou wel eens lang kunnen gaan duren. In veel gevallen is dit zelfs niet te doen. Enter bootstrapping. Waarom het beestje deze naam gekregen heeft zal me een raadsel zijn en google heeft hier vast een antwoord op, maar mooi en belangrijk is weten hoe het werkt.

Continue reading “3½. Bootstrapping”

4. Puzzelstukken combineren, modelleren, verklaren.

Gefeliciteerd! U heeft het einde gehaald, terwijl ik nog zo mijn best heb gedaan om lezers af te schudden. Maar daar zijn we dan: wat leren al deze experimenten, data-analyse, statistisch geneuzel enzovoorts ons allemaal? Waar doen we het voor? Begrijpen we de wereld om ons heen nu ook beter? De experimenten, bestaande literatuur, statistiek en andere dataverwerkingsmethoden zijn allemaal stukjes van een puzzel, of geven ons een idee hoe de puzzel in elkaar gezet kan worden, maar uiteindelijk gaat het om het oplossen van de puzzel.

Een eerste stel puzzelstukken die we nu hebben bestaat uit informatie over de structuur van de polymerase hebben:

Polymeriseren kun je leren.

Aan de de dwarsdoorsnede van de polymerase kun je zien dat het molecuul 3 tunnels heeft die in het midden samenkomen. Dit ligt redelijk voor de hand: binnenin de polymerase wordt enkelstrengs RNA omgezet (gepolymeriseerd) naar de vertrouwde dubbele helixvorm. De eerste tunnel gaat enkelstrengs RNA naar binnen, tunnel 2 voert dubbelstrengs RNA naar buiten. Om dit te kunnen doen heb je ook aanvoer van bouwstenen nodig (NTPs dus), hier is tunnel nummer 3 voor. Rechts zie je hoe dit in het experiment gebeurt.

Continue reading “4. Puzzelstukken combineren, modelleren, verklaren.”

Collective lab exits

The Nynke Dekker lab at CERN.

Just for a mid-week then. Roughly once every two years a couple of us get together to organize an outing for the Nynke Dekker Lab. 2012 took us to the EPFL in Lausanne and CERN in Geneva, in 2014 we spent a couple of very active days in the Belgian ardennes. No idea where our next trip will take us, let alone if I will still join as a lab member(!), but you’ll be able to find us here.

Continue reading “Collective lab exits”

Back to reality

And yet another academic year kicks off again. What year is this? 2014, check. Which year did I start? 2011, check. Whoa! Wait a minute – three years have gone by?! How did that happen? Why didn’t anybody tell me?! So my last year has started?? Oh boy [picture me becoming pale in the face], in a year’s time I’m expected to have written a book, drawn some very profound and groundbreaking conclusions and am expected to head off to the next step in my career? Oh boy!

“Ah”, I hear post-docs thinking, “the final year grad student – been there, done that. Feel so sorry for those guys (NOT!)…” Well, I guess last-year grads are easy to recognize: walking hastily through the corridor, a bit pale faced, sleep deprived, maybe a nervous twitch or two. You’ve got it, that’s us. To be honest, I actually don’t feel all of this (yet), but the what’s next? question has definitely been popping up in my mind more often these days. Three years ago, doing a Ph.D. to me was a form of safe and comfortable intellectual escapism, curiosity-driven but also having that delightful feeling of being allowed to not think about what next? for the following three years. But here I am again: what’s next?

Continue reading “Back to reality”