2. Onbevooroordeelde dataverwerking: de dwelltime-analyse.

Goed, je hebt je x,y,z data, en dan? Dwelltime-analyse is een abstracte term voor een vrij eenvoudige methode. Niet al te ingewikkeld dus, maar eerder op dit soort data toegepast? dat niet. Wat ik eerder heb laten zien was dat een polymerase dubbelstrengs RNA omzet in enkelstrengs RNA (een verplaatsing van y baseparen) over een tijd x. Met andere woorden, de polymerase heeft een snelheid gemeten in baseparen per seconde, die we willen weten. Als die snelheid constant zou zijn is het makkelijk: de verplaatsing uitgezet tegen de tijd is dan lineair – de snelheid zouden we meteen af kunnen lezen.

Positie van RNA polymerase versus tijd.

Dat is in feite wat er tot nu toe altijd gedaan is: de polymerasesnelheid wordt gemeten voor elk stukje van het (door de polymerase afgelegde) traject waarvan het lijkt dat de snelheid constant is. Met andere woorden: elk stukje van het traject waar je een rechte lijn tegenaan kunt leggen levert je een snelheidsvector op. Klaar! Zou je zeggen. Maar: hoe weet je zeker dat een stuk waar je een lijn tegenaan legt ook daadwerkelijk een constante snelheid vertegenwoordigt? Akkoord, voor een ruwe schatting is dit prima, anno 2005 had je zo in Nature gestaan. Maar het is 2015 en een meting aan een enkel molecuul is geen wereldwonder meer. Toch vormen dit soort metingen een onmisbare bron aan informatie over de dynamiek van deze moleculaire kopieermachines.

Continue reading “2. Onbevooroordeelde dataverwerking: de dwelltime-analyse.”

2½. Dwelltimedistributies

Dacht je naar punt 3 door te kunnen, krijg je dit! Toch eerst maar even kijken wat ik precies bedoel met de dwelltimedistributies. Stel je hebt een dataset die alle verkregen dwelltimes van een experiment bevat, een lange lijst met tijden dus. De set die ik hier heb bestaat uit 15417 tijden verkregen door 60 trajecten op te knippen in stukken van 10 baseparen. Op die 10 baseparen kom ik aan het eind weer terug, nu eerst de tijden. Het minimum ligt bij 0.08 seconden: de polymerase vestigde een snelheidsrecord in dat stuk. De langste tijd – met andere woorden langste pauze – duurde 98.8 seconden. Alle andere 15415 punten liggen dus daar ergens tussenin. Je kijkt hoe de verdeling van tijden eruitziet door de data in een histogram te stoppen. Hierbij verdeel je die kleine 100 seconden in tijdsintervallen van gelijke grootte (bins) en tel je hoeveel van de tijden er binnen elk tijdsinterval liggen:

Abnormaal verdeeld: Als je het zo bekijkt lijkt er nauwelijks een dwelltime boven de 5 seconden te liggen..
Ondergesneeuwde data: Maar als je inzoomt zie je dat er toch nog wel wat datapunten bij hogere tijden liggen!

Daar is niet veel anders over te zeggen dat de overweldigende meerderheid van de dwelltimes niet veel langer is dan zo’n 5 seconden. Tijd voor een logaritmisch geschaalde histogram (log-histogram):

Dezelfde data op een logaritmische tijdschaal.

Continue reading “2½. Dwelltimedistributies”

Opstartfase voorbij

Dat een promotieonderzoek van vier jaar een vrij lange periode is om ergens helemaal in te duiken, zal haast eenieder beamen. Maar eenmaal begonnen aan zo’n traject, lijkt de tijd die je voor je onderzoek hebt gekregen ineens toch een stuk minder onmetelijk. Na vier maanden acclimatiseren, inlezen, experimenteren en bijleren in Delft, moet mijn eigen project nog goed en wel beginnen. Eén twaalfde voorbij; de eerste maand van mijn PhD-‘jaar’ verleden tijd. Wat heb ik in vredesnaam afgelopen tijd uitgespookt?

“doe mij wat ntps aub” – schematische voorstelling van een RNA-polymerase.

Tijd verspild heb ik gelukkig allerminst; mijn eerste maanden laten zich goed omschrijven als learning on the job. In samenspraak met mijn promotor Nynke Dekker hebben we in den beginne besloten dat mijn wens om de wereld van de single-molecule biophysics (enkel-molecuul biofysica vind ik echt te vreemd klinken, ik hou de anglicaanse benaming wel aan) in te duiken zou worden vervuld door middel van experimenteren met behulp van de magnetische pincet (officieel magnetic tweezers natuurlijk, hier vind ik het Nederlandsch nog net kunnen). De zeer pientere, bourgondisch ingestelde en ietwat chaotische post-doc tevens ontzettende Fransman David Dulin werd mijn mentor om me dit experimenteel trucje (fijne kneepjes van het vak incluis) aan te leren. Naast een zeer goede samenwerking te hebben gehad, hebben we zijn project aan de RNA-afhankelijke RNA-polymerase succesvol naar een afrondende fase weten te brengen. “Juist. Magnetische pincet, een RNA-wat?” hoor ik sommigen nu denken. Hier komt ie dan:

Continue reading “Opstartfase voorbij”